作者：DJ孟
circRNA是一类闭合环状的非编码RNA分子，起初被认定为是转录副产物，但后来随着高通量测序和实验技术的不断发展，人们发现了很多具有功能的circRNA。研究表明circRNA在生物的生长发育、疾病的发生和发展过程中发挥着重要作用，其在疾病诊断标记物方面有很大的应用前景。
本文围绕circRNA的形成与鉴定、功能机制和circRNA的上下调方式等展开阐述，希望能为初进circRNA研究领域的新手小白提供帮助！
一、circRNA的形成
根据circRNA的组成结构不同，将其分为内含子ciRNA、外显子ecircRNA和内含子-外显子ElciRNA三类。不同类型circRNA的成环机制也有所不同，主要有4种：
（1）环化外显子5’和3’剪接处通过不断组装小核核糖体蛋白，形成套索结构，引起外显子跳读，驱动环化；
（2）环化外显子的两侧翼内含子通过碱基互补配对，形成并排双链从而驱动环化；
（3）RNA结合蛋白（RBP）通过结合侧翼内含子序列，促进外显子的环化；
（4）内含子依靠5‘和3’端的motif序列反向拼接驱动环化，后经剪切形成成熟的circRNA。
知道circRNA的组成和环化机制后，我们可以挑选表达差异较显著的circRNA进行序列分析，并做下一步的环状结构验证。
circRNA的形成机制图9
二、circRNA的鉴定
针对circRNA环状结构的鉴定，第一步就是先针对环化序列两侧设计反向引物，sanger测序得到拼接位点序列。因为circRNA是闭合环形，比线性RNA结构稳定，可以利用R NaseR外切酶消化总RNA，检测消化前后circRNA的表达,富集到大量的circRNA。
另外，利用特异性探针进行Northern blot检测和转录抑制剂放线菌素D检测半衰期，进一步证明circRNA的环状结构。
最后，要想研究circRNA的功能机制，首先要知道circRNA在细胞中的定位，不同定位的circRNA对应的功能机制也不同，可以通过核质分离和FISH检测circRNA的细胞定位1。
三、circRNA的作用机制
对于定位在细胞核内的circRNA主要有2种作用机制：
a. circRNA可以与环化位点处的宿主基因结合，通过形成 RNA-DNA 杂合体（R 环结构）使基因转录暂停或终止，导致表达转录本被截短2；
b. EIciRNA通过与 U1 snRNP 、Pol II 相互作用于亲本基因启动子区，从而增强基因的转录过程3。（详细参考:核内circRNA的机制研究如何开展？）
circRNA的作用机制图9
而定位于细胞质内表达的circRNA作用机制大致有4类：
c. ceRNA机制，算是比较经典并且做得最多的研究思路。CircRNA通过充当miRNA的分子海绵，上调miRNA靶标mRNA的表达。比如CDR1as包含63个保守的miR-7结合位点，它通过间接调控miR-7靶标mRNA的表达，影响斑马鱼中脑的发育4和肿瘤疾病等进程5。
d. circRNA通过与蛋白互作，进一步促使蛋白之间结合或分离，可能也会导致结合蛋白在细胞核或细胞质中滞留。另外，circRNA能够促进RBPs与mRNAs的结合，从而通过稳定mRNAs促进翻译过程，如circPOK与白介素增强子结合因子2/3(ILF2/3) 复合物作用，稳定了IL-6和VEGF，间接调控肿瘤的发生过程6。
最后2种功能机制与circRNA的翻译潜能有关。
比如e. 具有ORF和IRES元件的circRNA可以直接招募核糖体启动翻译。
f. 对于那些没有IRES，但是含有M6A位点的circRNA通过识别并结合YTHDF3，招募eIF4G2，从而起始翻译7。（关于circRNA编码的预测和验证，详细可参考:突破认知：LncRNA、circRNA编码啦！！）
四、circRNA的上下调
如果要研究某个感兴趣的circRNA作用机制时，那研究过程中一定少不了对circRNA进行敲低/敲除和过表达。
对于敲低circRNA来说，首先要针对circRNA环化拼接位点处设计特异性敲低靶点，这样可以防止对亲本基因的敲低。另外，由于RNA诱导沉默复合体存在细胞质中，所以，一般siRNA对细胞核内的circRNA敲低效率较低，这时可采用化学合成的ASO敲低基因的表达3。
如果要敲除掉circRNA的话，由于circRNA侧翼内含子中的短散在元件SINE（Alu）序列有助于外显子环化，所以可以利用CRISPR/Cas9技术将侧翼内含子的Alu序列敲除，通过阻止反向剪接过程达到circRNA敲除的目的，同时也能避免对亲本基因的表达产生影响8。但是，这可能存在ALU选择困难或者影响其他circRNA形成的问题。对于内含子circRNA，可以将整个内含子敲除掉。但是由于CRISPR/Cas9敲除操作复杂，动物水平敲除效率较低，所以一般建议先做siRNA敲低，如果敲低无效再选择敲除的方式。
针对circRNA的过表达，主要有2种构建方法：
a. 由于circRNA本身就能环化，所以将circRNA两侧的内含子序列充当环化臂进行构建；
b. 另外，也可以取一侧内含子序列1kb，另一 侧构建互补序列充当环化臂，最后检测circRNA的过表达效率，取最佳构建方式3。
不过，现在不用那么麻烦去检测哪种方式效率最高，直接把circRNA线性序列插入到商业化的circRNA过表达载体（带有环化臂）中，即可驱动环化实现过表达。
实际上，circRNA的功能最终涉及与其他分子的相互作用，虽然我们知道了很多机制，但是仍然存在很多问题没有答案。比如：有没有与circRNA结合的ncRNA或其他分子？是什么决定了circRNA成为蛋白的支架？应该怎样分析位于其他细胞器中的circRNA呢？或者怎样能将circRNA递送到特定的亚细胞区？怎样才能观测到体内实时circRNA-蛋白质相互作用的过程呢？等等这些都需要我们不断地探索。
在探索过程中，吉凯基因可以为广大老师们提供ceRNA机制荧光素酶构建、circRNA编码验证、circRNA过表达载体构建、circRNA敲低/敲除等方案设计。另外，吉凯拥有质粒、慢病毒、腺病毒和AAV多种工具载体，满足老师们的大部分实验需求，助力老师们在circRNA领域的实验研究。
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参考文献…
1.Ri Chen, et al. N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nature Communications. 2019, 10(16): 4695
2. X Xu, et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 2020, 19(1): 128
3. Z Li, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nature structural & molecular biology. 2015, 22(3): 256-264
4. Zhong Q, Huang J, Wei J, Wu R. Circular RNA CDR1as sponges miR-7-5p to enhance E2F3 stability and promote the growth of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Cell Int. 2019, 19: 252
5. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013, 495(7441): 333–8
6. Guarnerio J, Zhang Y, Cheloni G, Panella R, Mae KJ, Simpson M, et al. Intragenic antagonistic roles of protein and circRNA in tumorigenesis. Cell Res. 2019, 29(8): 628–40
7. Y Yang, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Research, 2017, 27: 626-641
8. Q Zheng, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016: 11215
9. W Zhou, Z Cai, J Liu, D Wang, H Ju and R Xu. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Molecular Cancer, 2020, 12: 172