「DIFF CRO」服务平台可针对FIPV疫苗及药物进行有效性评价。在候选药物的细胞水平筛选阶段，可进行真病毒小分子药筛，另外针对猫传腹的蛋白酶靶点，「DIFF CRO」独家开发了蛋白酶抑制剂筛选系统以帮助研发企业加速进程，为早日实现合规兽药、疫苗上市争取更多时间。

FIPV真病毒小分子药筛

针对FIP小分子治疗药物，DIFF CRO搭建了基于真病毒体系的体外药效筛选平台，用于系统评估候选化合物对病毒在细胞内复制过程的抑制能力。该平台采用标准化培养体系和经过验证的FIPV真病毒株（见表1），在严格的生物安全条件下开展实验，能够更真实地反映候选药物在细胞环境中的抗病毒活性（图6），为早期药效判断和化合物优选提供可靠依据。

表1. 使用的FIPV毒株型别

图6. 某样品对FIPV WSU79-1146毒株的抑制率曲线

基于DIFF-rGFP系统的FIPV蛋白酶抑制剂筛选

FIPV病毒的多聚蛋白的裂解由两种蛋白酶调控：主要蛋白酶（3CLpro，也称为Mpro或nsp5）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）。3CLpro在病毒生命周期中发挥的重要作用，使其成为药物设计的一个有吸引力的重要靶点。而由「DIFF CRO」独家开发的蛋白酶抑制剂筛选系统（DIFF-rGFP ），可在细胞水平直接模拟病毒自然感染过程，杜绝漏筛和假阳性等情况，在新药早期发现阶段快速筛选大量化合物，其拥有诸多优势：

1）最简便：肉眼观测

DIFF-rGFP可通过肉眼直接观察药物反应的荧光变化（图7），进行定性判断。

图7. 使用DIFF-rGFP进行FIPV阳性药物GC376筛选的荧光变化图

2）最准确：原理可靠

DIFF-rGFP 是基于特制质粒的共表达机制，以FIPV为例，结合重组绿色荧光蛋白（rGFP）和FIPV的3CL蛋白酶。在该系统中，rGFP序列中嵌入了3CL蛋白酶的特异性切割位点。当3CL蛋白酶功能正常时，会特异性裂解rGFP，导致其荧光功能丧失，荧光强度减弱。相反，当抑制剂有效抑制了3CL蛋白酶的活性时，rGFP无法被切割，维持其完整性并正常发出荧光，荧光强度增强（图8）。药物有效性与荧光强度成正相关，是一种更直观的正向筛选方式。

图8.DIFF-rGFP工作原理图

3）快速高效的高通量筛选

系统检测的荧光值低而信噪比好，可联合现有药物库，一周即可筛选1万-10万个抗FIPV药物候选化合物，快速锁定有效药物（图9）。

图9. 高通量筛选操作示意图

4）稳定且可重复

DIFF-rGFP 检测呈现出更渐进的反应，因为它测量的是荧光强度，而不是直接测量病毒复制情况（图10）。这种更平稳的反应可能会缩小检测的动态范围，但能提供更稳定且可重复的检测结果。

图10.DIFF-rGFP检测的半数有效浓度（EC50）

「DIF CRO」凭借其独有的DIFF-rGFP蛋白酶抑制剂筛选系统，为FIPV药物研发提供了简便直观、准确可靠、高效快速且稳定可重复的体外药效评价方案。该平台将复杂筛选过程转化为直观的荧光信号，结合真病毒药筛，构成多方法评估体系，能极大加速候选化合物的早期发现与优化进程，是助力新一代猫传腹疗法从实验室走向临床的关键加速器。

参考文献：

Jin M, et al.Practical approach to development of GS-445124-loaded PLGA nanoparticles for the long-term treatment of feline infectious peritonitis caused by feline coronavirus infection. Int J Pharm. 2025 Apr 15;674:125468.

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